Toxonomia, ecologia e mecanismos envolvidos na infecção e colonização de plantas de cana-de-açúcar (Saccharum sp. hibrido) por bactérias diazotróficas endofíticas do gênero Herbaspirillum

Abstract

O gênero Herbaspirillum foi descrito como um grupo de bactérias diazotróficas associado às raízes de gramíneas, possuindo uma única espécie, Herbaspirillum seropedicae. Através da hibridização de RNA e DNA, foi proposta a reclassificação de “Pseudomonas” rubrisubalbicans, agente causal da estria mosqueada da cana-de-açúcar, como Herbaspirillum rubrisubalbicans. Na primeira parte deste trabalho foram conduzidos testes comparativos entre H. rubrisubalbicans e H. seropedicae. Dentre as características testadas, as espécies diferenciaram-se entre si pelo uso das fontes de carbono meso-eritritol e N-acetilglucosamina, quanto a temperatura ótima de crescimento, padrão de

flagelos e quanto a indução de estrias mosqueadas em cana-de-açúcar var.B- 4362. Sondas de oligonucleotídeos espécie-específicas demonstraram uma

correspondência total com os resultados dos testes de uso do meso-eritritol e N- acetilglucosamina na discriminação das espécies Herbaspirillum. Além disso,

soros policlonais produzidos e a análise do polimorfismo de bandas geradas por Inter-LINE PCR mostraram-se como ferramentas adicionais na distinção de isolados ao nível de espécie. Na segunda parte deste trabalho foram avaliados aspectos da ecologia da bactéria. Foi observado que H. seropedicae ocorre naturalmente em raízes, colmos e folhas de diversas espécies de plantas, predominantemente membros da família das gramíneas. Já H. rubrisubalbicans foi isolada apenas de cana-de-açúcar e raízes de uma gramínea invasora (Digitaria insularis). Herbaspirillum não foi isolado de nove espécies de plantas distribuídas

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em sete famílias, bem como de 10 amostras de solo não vegetado. A sobrevivência de Herbaspinllum spp. no solo foi baixa, atingindo números não detectáveis entre 3 a 4 semanas. A introdução da planta hospedeira elevou a persistência da bactéria no sistema solo-planta. Ademais, foi possível reisolar a bactéria após a introdução de sementes de sorgo em solo cuja população havia atingido números não detectáveis por mais de 6 semanas. Em experimentos de inoculação, demonstrou-se que a população de Herbaspirillum spp. no interior das raízes de plantas micropropagadas de cana-de-açúcar caiu muito pouco, estabilizando-se em torno de 104 células. g-’ de raízes, enquanto que na parte aérea flutuações maiores foram observadas. Efeitos deletérios significativos (a = 5%) na acumulação de matéria fresca de raízes e da parte aérea de plantas de cana-de-açúcar foram observados no tratamento nitrogenado, aos 12 e 24 d.a.i.. A partir de 64 d.a.i., o tratamento com nitrogênio aumentou significativamente (a = 5%) o acúmulo de matéria seca. Acúmulos significativos (a = 5%) de matéria fresca da parte aérea foram obtidos aos 24 d.a.i. com H. seropedicae estirpes Z67 e HRC54 comparadas ao controle e a testemunha nitrogenada. Na terceira parte do trabalho, a infecção e colonização de plântulas de cana-de-açúcar por Herbaspirillum foram investigados utilizando técnicas de microscopia. Demonstrou-se que 1 d.a.i., as bactérias encontravam-se aderidas a superfície das raízes por meio de ataque apolar em monocamada. Herbaspirillum infectou às raízes nas zonas de emergência de raízes laterais e regiões de ruptura de células da epiderme. A colonização do interior das raízes ocorreu pela multiplicação das bactérias nos espaços intercelulares das células do córtex. A colonização do interior do córtex foi seguida pela infecção do cilindro central, que ocorreu principalmente próxima as regiões de emissão de raízes laterais. No tecido vascular, Herbaspirillum colonizou os meatos celulares e o interior das células de parênquima vascular, invadindo os vasos do xilema. A aplicação da técnica de imuno-ouro, utilizando anticorpos policlonais contra Herbaspirillum spp. confirmaram a identidade das bactérias observadas ao microscópio. No quarto capítulo, avaliou-se a reação de duas variedades de cana-de-açúcar contrastantes quanto a sensibilidade a estria mosqueada, a inoculação com diferentes estirpes

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de H. seropedicae e H. rubrisubalbicans, bem como a reação de sorgo. Embora todas as estirpes de Herbaspirillum tenham sido reisoladas próximas ao ponto de inoculação, apenas estirpes de H. rubrisubalbicans incitaram sintomas típicos da doença em sorgo e cana. H. seropedicae não incitou sintomas em nenhuma das

plantas, induzindo uma resposta hipersensível em ambas variedades de cana-de- açúcar testadas. Observações ao microscópio revelaram um padrão bem distinto

de colonização da planta que foi função da espécie de Herbaspirillum, da espécie de planta e do genótipo utilizado. No caso da var. B-4362 (susceptivel), H. rubrisubalbicans colonizou e obstruiu o Iúmem dos vasos do xilema. Em adição, invadiu e multiplicou-se nos espaços intercelulares das células do mesófilo. Diferente da var. SP 70-1143, onde H. rubtisubalbicans mesmo colonizando os vasos do xilema, formou dentro dos mesmos microcolônias em intima associação com a parede secundária, jamais obstruindo o Iúmem do vaso. O mesófilo da var. SP 70-1143 foi menos extensivamente colonizado, com menor densidade de bactérias e maior síntese e deposição de gomas, comparado com a var. B-4362. Imunomarcação comparativa de H. rubrisubalbicans colonizando as duas variedades de cana sugeriu que no caso da interação com a variedade B-4362, H. rubrisubalbicans produziu maior quantidade de exopolisacarídeos (EPS).Esta maior produção pode estar envolvida com o estabelecimento da interação enferma. Com relação a plantas de sorgo, H. rubrisubalbicans permaneceu confinado ao interior dos vasos do protoxilema e do metaxilema. A densidade de colonização do vaso refletiu na maior ou menor expressão de sintomas com as bactérias colonizando completamente o Iumem dos vasos em algumas regiões mais avançadas da doença e havendo grande síntese de gomas e formação de microcolônias encapsuladas em regiões de transição entre tecido com e sem sintomas. H. seropedicae embora presente em intima associação com os vasos, parece não ter eliciado nenhuma resposta de defesa na planta.