Espectrofotometria e análise de imagens: correlação entre métodos aplicados a quantificação de DNA

Abstract

A correta determinação da concentração de DNA, assim como a qualidade do mesmo, é essencial para estudos em biologia molecular. Para isto, várias técnicas vêm sendo desenvolvidas, entre as quais pode-se citar, análise de imagens computacionais, fluorímetros (que realizam a quantificação de DNA, RNA e proteínas através da utilização de corantes fluorescentes), e equipamentos como nanodrop e espectrofotômetro. As análises de imagens podem ser empregadas em estimativas de área foliar e em controle de qualidade em diagnósticos laboratoriais, com menor custo. O objetivo deste trabalho foi estimar a correlação entre a quantificação de DNA em espectrofotômetro e nanodrop, com intensidade de pixels via análise de imagens digitais de géis de agarose obtidos na eletroforese, visando permitir a padronização futura da diluição das amostras de DNA extraídas. Com o intuito de estimar as concentrações de DNA bruto de 20 acessos de Lippia alba pertencentes à Coleção de Germoplasma da UFRRJ, via análise imagens, efetuou-se a quantificação através da delimitação de uma área retangular na região onde se encontrava DNA, e utilizando o software ImageJ através da ferramenta Plot Profile obteve-se um gráfico informando as variações no tom de cinza obtidos na imagem, e posteriormente, através do ícone List obteve-se a lista referente aos valores de pixels que podem variar de 0 a 255; através do nanodrop as concentrações foram obtidas em ng.μl-1, assim como em espectrofotômetro. Para estimação da pureza das amostras, através do nanodrop e do espectrofotômetro foram realizadas leituras de absortividade nos comprimentos de onda 230, 260 e 280nm, pelos quais foi possível obter a concentração de DNA (ng.μl-1) e estimar a pureza das amostras pela relação A260.A230-1 e A260.A280-1. Os valores das razões destes comprimentos de onda indicam os níveis ideais de pureza das amostras. Os dados referentes às concentrações adquiridas por nanodrop apresentaram maior coeficiente de variação (43,03%), enquanto a análise de imagens apresentou o menor valor (17,69%). As correlações mostraram uma maior equivalência entre análise de imagens e espectrofotômetro visto que o valor foi mais significativo sendo de 0,84, enquanto o valor entre análise de imagens e nanodrop apresentou valor mais baixo, sendo de 0,01. Este fato pode ser respaldado pela percentagem de correlações negativas obtidas entre as metodologias de análise de imagem e espectrofotometria, sendo de 55 e 15% entre análise de imagens e nanodrop e, análise de imagens e espectrofotômetro respectivamente. Para a variável pureza, os valores encontrados mostraram-se mais próximos quando associado análise de imagem à nanodrop e espectrofotômetro no comprimento de onde A260.A230-1 (0,36 e 0,40 respectivamente), e bastante diferentes quando considerado o comprimento de onda A260.A280-1 (0,16 e -0,15 respectivamente). Estas correlações baixas e/ou negativas podem ser devidas a detecções de RNA nas amostras que não são captadas nas imagens relativas à eletroforese em forma de intensidade de pixels. A quantificação através de análise de imagens utilizando-se a intensidade de pixels, como forma de inferir sobre a qualidade do DNA, mostrou-se bastante viável quando comparada com os demais equipamentos utilizados. A quantificação da intensidade de pixels das imagens correlacionou-se de forma mais relevante com o espectrofotômetro.